Ⅰ 核移植的具体方法
哺乳动物核移植技术研究进展哺乳动物核移植是将外源的一个细胞核与一个去核卵母细胞结合，产生遗传上同质的动物的技术。它在动物育种、制备转基因动物、基因治疗及器官移植等方面具有重大的作用。 供体核可以是早期胚胎细胞、胚胎千细胞和体细胞。早期都采用合子核到64细胞期的胚胎细胞核质体分裂球作供体细胞核，80年代开始，随着胚胎干细胞（embryo stem cells，ES）的建立和对其研究的深入，人们对胚胎干细胞在核移植方面的应用前景寄予厚望，但ES建系太困难，仅在小鼠上获得成功。Teruhiko Wakayama等利用ES系克隆小鼠，结果有29%的重构胚在体外能发育到囊胚阶段，移植给假孕小鼠有8%胚胎附植并产下小鼠。1997年Dolly羊的出现，开始了体细胞的核移植，并发展很快。
1.1胚细胞
用0.2%链霉蛋白酶预处理胚胎，溶去胚胎的胶膜及透明带，分离出单个卵裂球。消化透明带的时间是影响卵裂球质量的重要因素，作用时间短，透明带不能充分消化，卵裂球不易获得；作用时间长，则影响到卵质膜，容易破裂，在操作时容易失败。因此，在分离卵裂球时应在解剖镜下监视透明带的消化过程，当透明带变薄，膨胀适度时就应移出，再用适当口径的吸管吹打使之分离。另外，苏格兰学者Campbell等显微分离胚盘细胞并在体外进行缺血饥饿传代培养，诱使细胞处于“静止”状态，以便调整染色体结构，从而有助于核的重组与发育，他们使用这种方法建立了绵羊TNT4细胞系，该细胞形态类似于胚胎干细胞，但更扁平、上皮化。
1.2体细胞
最早用青蛙肠粘膜上皮细胞获得了后代。Wilmut等用绵羊乳腺细胞获得Dolly羊。美国夏威夷大学Ryuzo Yanagimachi教授领导的一个国际科研小组于1998年以小鼠卵丘细胞为核供体，采用吸移管注入，利用机械和化学激活方式进行细胞的融合，成功培育三代克隆小鼠。对小鼠、牛体细胞移植的相关研究中发现休眠（G0）的颗粒细胞核与去核MⅡ期卵母细胞构成的体细胞重构胚，其发育率及产生克隆后代的能力远高于其它类型的休眠体细胞，这可能缘于颗粒细胞上存在着与卵母细胞紧密联系的胞质微绒毛桥的缘故，它或许有助于供体核同受体核胞质因子的交换。 作为细胞核移植的受体细胞主要有三类：去核的卵母细胞、受精卵和2-细胞胚胎，其中卵母细胞应用最为广泛。有人用两个去核卵母细胞融合后产生的胞质作为受体进行各代核移植，以增核移植胚胎的细胞数和提高继代移植效率。研究证明，体外成熟培养的卵母细胞核移植成功率不如体内成熟的卵母细胞，其原因可能是卵母细胞在体外成熟过程中，需要合成一些蛋白质来完成第一次减数分裂，体外成熟的一些卵母细胞其活动有可能受到抑制。
2.1卵母细胞的去核方法
2.1.1盲吸法用微细玻璃管在第一极体下盲吸，吸除第一极体及处于分裂中期的染色体和周围的部分细胞质，但该方法成功率低。为提高去核率，利用Hoechst33342染料对染色质的特异性染色作用，在荧光显微镜下去核后判断去核是否完成，去核准确率大为提高。Stice等用Hoechst33342(1μg/ml）染色，在紫外线下照射的时间控制在10s以内，未观察到对胚胎发育的负面影响。
2.1.2半卵法用微细玻管针在透明带上做一切口后，用微细玻管吸去一半染色质至另一半空透明带内，即将卵母细胞分为两半，然后用Hoechst33342染色，确定不含染色体的一半为细胞质受体。其操作方法如下，将卵母细胞移入35mm含有mPBSA（磷酸缓冲液，其中有D-葡萄糖1000mg/l、丙酮酸36mg/l、0.4%牛血清白蛋白、1%青霉素和链霉素10000μg/ml）的皮氏培养皿中进行显微操作，首先分两步进行分割透明带，即先在透明带上切一小口，然后用另一切割针扩大切口，从而分割透明带。透明带被切除后转移到含有mPBSA+5μg/ml细胞松弛素B的35mm的皮氏培养皿中作用3一5min，然后用固定针(内径为透明带的l/5一1/3，外径接近透明带的直径）固定，分割针进入透明带的隙口中并将该针固定在靠着透明带的地方，缓慢吸取卵母细胞液，当分割针中吸取了一半卵母细胞液时，这时将该针从卵黄隙中移出，并靠着透明带切割边缘轻微地擦过以达到完全的分割，将其针中的卵母细胞液移入准备好了的空透明带中，并用Hoechst33342染色，荧光显微镜下观察不发荧光的作为受体卵母细胞。
2.1.3离心去核Tatham等以15000g、2min离心牛卵母细胞，用链霉蛋白酶去除卵母细胞透明带（ZP），经渗透压梯度离心，MⅡ期纺锤体可从大多数卵母细胞中分开，把无透明带的去核胞质作核移植的供质，同分裂球聚集经电融合成核移植胚，最后放入藻酸钠假透明带中，能在体外卵裂和发育，但其效果还有待于进一步研究。
2.1.4 末Ⅱ期去核法Bordignon等提出把卵母细胞先激活使之处于末Ⅱ期，在排出第二极体时吸出第二极体及周围的少量细胞质，从而达到去核。这种方法避免使用DNA染料和经紫外线照射来定位染色体，并且去除的细胞质相对较少。该去核方法比MⅡ期去核的成功率有显著提高，但这种细胞质容易老化，是否能对基因组完全重排序，顺利完成后期发育，有待于研究。2.2 去核时间与去核成功率
多数研究者在多数卵母细胞出现第一极体的成熟时期去核，去核时间，体内成熟在发情开始后48h，体外成熟22－24h。卵母细胞去核程序与重构胚中再程序化状况密切相关，去核率越高，其克隆胚最终发育成正常胚的可能性越大。去核率的高低与卵母细胞所处的成熟时期以及所采用的方法密切相关。以前的核移植研究均采用未激活的卵母细胞作为核受体，并认为激活后卵母细胞的重排能力会下降，影响核移植的效率。但Ushijima，等和Terlovw等；研究表明，激活后的卵母细胞作为核供体时，重构胚融合和发育能力均优于融合激活同时进行的效果。
2.3 胞质容士与重构胚的发育潜力
有人对核反比例与重构胚发育的关系进行研究，结果表明，卵母细胞去除的胞质量与预期供核体积大小相当时，可以为细胞周期的相互作用创造最好的条件，而去除太少或太多并不理想。基于去除细胞质的量与去核率关系切，因此，在保证有较高的去核情况下。去除的胞质应尽量少。 4.1 融合与激活
由于微吸管破坏了卵膜和一部分细胞质，若直接移植，成功率很低，故需对重组胚融合，其采用的方法有仙台病毒法、物理或化学方法（如电融合法、钙离子载体、乙醇、蛋白质酶合成抑制剂等）激活受体细胞，使其完成细胞分裂和发育过程，电融合法更常用。电融合时选择的电压范围和脉冲频率取决于融合箱中两个电极的距离。融合箱的距离由200μm，到几毫米，因此在脉冲是200μsec倍数且能传导lKV/cm的直流电基本满足要求。对小鼠、家兔等实验动物进行胚胎核移植时还发现，受体卵母细胞在重构胚电融合时被激活的状态与重购胚的发育率密切相关，脉冲强度为2.0-3.6K/cm、融合时间为60-200μsec是适宜范围。若脉冲过强，融合时间过长，对重构胚的进一步发育极为不利。Kono等提出针对不同时期的供体核采取不同激活程序得到了较好的实验结果：①对于G2期和M期的供体核即4倍DNA供体，在融合时可采用不引起卵母细胞活化的仙台病毒或细胞质内注射，然后再给予激活处理，使一半DNA以极体方式排出，随后形成原核及正常2倍体细胞，应用此法已产生了正常的小鼠；②对于G0、G1及S期供体核，可采用融合前激活和融合时激活两种方式，以防止供体核形成中期板而导致染色体的不正常。Szollosi用小鼠胸腺细胞作核移植实验时发现，只有成熟的去核卵母细胞被激活前或激活后30min进行融合，移入的供体细胞核才发生降解，并重新聚合形成新核膜，若超过30min再触合，虽然移入的供体核才发生降解，这可能会使供体染色质与受体细胞质诸因子的有效互作受到抑制，从而使再程序化过程受阻。Wakayama等人利用受体卵母细胞化学激活和重构胚化学融合的方法，也在小鼠体细胞克隆和再克隆的研究中取得了理想的结果。
对兔卵电融合完成后，卵母细胞也因电刺激受到激活从而开始新的编程和发育，但对小鼠、大鼠和牛等还需进一步充分的激活才能获得发育。其方法有化学和电激活两种，化学激剂有7%乙醇、Ionomycin（离子霉素）、钙离子载体A23187，采用Ionomycin激活后再用6-DMAP处理3h，可避免出现PCC（早熟染色体凝集），并增加羊重构胚的发育率及出生率。
4.2 融合率与细胞期
Prather等（1989）研究结果表明，融合率与细胞期无显著差异，说明卵裂球体积变小对融合率并无显著的影响，张涌（1992）在小鼠研究中也得出类似的结果。Robal等也认为，融合率与受体卵母细胞的时龄有关，并且还与核供体接触的面积和接触的紧密程度有关，而与移入的卵裂球处于什么时期无关，但是重构胚的发育率与供体胚的细胞期是有关的。
4.3 温度、卵母细胞成熟时间对卵母细胞激活的影响
随着卵母细胞在体外成熟时间的延长，进而老化，成熟促进因子（MPF）下降，易激活。体外成熟老化的牛卵母细胞对温度诱导激活高度繁感，在一定的温度诱导激活下，卵母细胞染色质聚缩，“自动去核”的频率高。幼稚卵母细胞不容易在室温下激活，即使激活也不稳定，可能逆转到中期。 重构胚需一定时间的培养，方可移植到受体，家兔和猪重构胚在体外培养24h以内，就可通过非手术移植，而羊和牛重构胚所需培养时间较长，一般发育到囊胚或桑堪胚时移植。培养的方法是可将电融合的重构胚放大10%FCS的RD微滴内培养，也可将显微操作的胚胎移入同种或异种的输卵管中进行培养，几天后冲洗输卵管，回收重构胚。后者的实验方法如下，先用琼脂和0.9%NaCI制成1.0%和1.2%琼脂糖，将1.0%的琼脂倒入35mm的皮氏培养皿中，当温度为37℃时将胚胎移入琼脂块中。应用琼脂切割针吸取一气泡和mPBSA+20%新生犊牛血清，然后吸取含有琼脂的胚胎，该针在室温下保持几秒钟后将其放入MPBSA+20%新生犊牛血清的皮氏培养皿中。当1.2%的琼脂温度达到37℃时，采用同上的方法在琼脂糖中洗涤几次，然后组成双层琼脂并采用手术移植到输卵管中。在体外进行重构胚的培养时，选择适当的培养液非常重要。重构胚的移植与胚胎移植的方法基本一样，即根据受体动物的不同可分为手术移植和非手术移植。
Ⅱ 链霉蛋白酶颗粒价格
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Ⅲ 卵巢卵泡发育的分离方法对移植卵巢卵泡发育的影响实验
目的
评估机械法、酶解法和酶解?机械结合法等分离方法对小鼠移植卵巢分离卵泡的发育及其生殖潜能的影响，建立更好的卵泡分离技术方案。
方法B6D2F1新生小鼠卵巢移植后分别用机械法、长时酶解法、短时酶解法或酶解?机械结合法分离卵巢组织中的腔前卵泡，分离回收卵泡在体外培养12 d时加入绒毛膜促性腺激素(hCG)处理26 h，收获卵丘复合体进行体外受精。
结果机械法的卵泡回收量、卵泡培养残存率、排卵率均高于酶解法，短时酶解法的排卵率高于长时酶解法;酶解机械结合法的平均卵泡回收量、平均排卵数、卵母细胞成熟率等多项指标均高于其他各组。
结论酶解机械结合法是分离小鼠卵泡良好的技术方案。
卵巢 卵泡 卵母细胞 培养技术 胚胎组织移植
人工诱导胚胎卵巢原始卵泡发育成熟可为受精机制研究和医疗性克隆提供充足的卵母细胞源。对异体移植发育到一定程度的卵巢进行生长卵泡分离是人工诱导卵泡发育的关键步骤之一[1?3]，迄今已经发展出两种卵泡分离技术，包括酶解分离法和机械分离法。这两种方法各有其缺点，使每个卵巢的卵泡回收率和成熟率均停留于较低水平。本研究探讨了酶解法、机械法和酶解?机械结合法等分离方法对小鼠移植卵巢分离卵泡的发育及其生殖潜能的影响，以期建立更好的卵泡分离技术方案。 1.1 动物 C57BL/6(B6)雌鼠、DBA/2(D2)雄鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[合格证：SCXK(沪)2007?005]，以B6雌鼠和D2雄鼠交配繁殖B6D2F1(F1)小鼠。小鼠饲养于恒温(25 ℃)动物房单笼独立通风系统(IVC?II型，苏州市冯氏实验动物设备有限公司)，光照14 h，黑暗10 h，自由饮水取食。
1.2 试剂 α?MEM?HEPES(42360?032)，α?MEM(32571?036)，胶原酶I(17100017)，脱氧核糖核酸酶(DNaseI，18047?019)及ITS(胰岛素?转铁蛋白?硒混合物)均为美国Gibco公司产品; rFSH(注射用重组人促卵泡激素，瑞士Serono公司);LH(黄体生成素，美国Sigma公司);hCG(中国丽珠集团丽珠制药厂);FCS(胎牛血清)，penicillin/streptomycin(青霉素/链霉素)及KSOM+AA(MR?106?D)均为美国Chemicon公司产品。
1.3 卵巢移植 B6雌鼠(8～10周龄)与D2雄鼠(10周龄)4∶1合笼培育F1代，次日查到阴栓者记为E0.5 d;以20 d为孕期，预产期前3 d每日早晚查看孕鼠是否生产;断颈处死新生12 h以内F1小鼠，取出双侧卵巢待移植。异戊巴比妥(15 mg/mL)麻醉成年(8～10周)F1雌鼠(移植受体)。消毒小鼠背部，在肋脊角区做纵向切口进入腹腔，切除双侧卵巢，然后在左侧肾被膜下植入新生小鼠卵巢2枚，层层缝合伤口。待受体鼠清醒后送回鼠舍。
1.4 卵泡分离 新生小鼠卵巢移植14 d后，将受体鼠断颈处死，从肾被膜下取出移植的卵巢，卵巢移植物约2 mm大小，表面可见丰富的重构血管，在体视镜下可清晰观察到卵巢移植物中的卵泡。用1 mL注射器(320310，美国BD公司)的针尖将每枚卵巢均匀横切为2块，4块卵巢组织混合后随机分组进行分离。
1.4.1 A组(单纯机械法) 将卵巢组织块转移至卵泡分离操作液(α?MEM?HEPES，10%FCS，100 IU/mL penicillin，100 mg/mL streptomycin，不含胶原酶和DNA酶)中，在带有37 ℃恒温热盘(MATS?U55SZX2A，奥林巴斯)的体视显微镜下，用精细尖镊 (直5#，T1?181，中国淮安特申医疗器械有限公司)剥离卵巢中的卵泡。每隔5 min，即将已剥离的完整卵泡转移至事先装有1 mL卵泡培养液(α?MEM，5%FCS，0.1 IU/mL FSH，0.01 IU/mL LH，1%ITS)的35 mm培养皿中。共分离4次，总时间约20 min。
1.4.2 B组(长时酶解法) 将卵巢组织块用1 mL注射器针尖均切为3小块，置于500 μL卵泡酶解液(α?MEM?HEPES，3 mg/mL胶原酶I，1 mg/mL DNase I)中，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中消化20 min，第20分钟时将其从培养箱取出，用200 μL移液枪吹吸消化液30次。在体视显微镜下将游离出的结构完整的卵泡转移至事先装有1 mL卵泡培养液的35 mm培养皿中。
1.4.3 C组(短时酶解法) 将卵巢组织块用1 mL注射器针尖均切为3块，置于500 μL卵泡酶解液中，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中消化，每隔5 min即从培养箱中将组织取出，用200 μL移液枪吹吸消化液30次，在体视显微镜下观察是否有游离的卵泡，如有则将卵泡迅速转移至装有1 mL新鲜培养液的35 mm培养皿中。共消化20 min。
1.4.4 D组(结合法) 将卵巢组织块用1 mL注射器针尖均切成3块，转移至500 μL卵泡酶解液中，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中消化5 min。然后在带有37 ℃恒温热盘的体视显微镜下，在卵泡酶解液中用精细尖镊分离卵泡。每分离5 min，即将已分离得到的完整的卵泡转移至事先装有1 mL卵泡培养液的35 mm培养皿中。共分离4次，20 min。
1.5 双荧光染色 每组随机选取部分分离卵泡，放入Calcein AM(4 mmol/L，Sigma，C1359)和Ethidium Homodimer?I(10 mmol/L，Sigma，E1903)混合液中，37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养45 min;卵泡悬液置倒置荧光显微镜观察，在蓝光的激发下，活的卵泡发绿色荧光，死的卵泡发红色荧光，分别计数死、活卵泡数。
1.6 卵泡体外培养 各组分离所得卵泡分别进行体外培养12 d。第0天，分离得到的卵泡培养在加有1 mL培养液的35 mm培养皿中;第1天，加入1 mL新鲜培养液;此后每天半量换液;第12天全量换为卵泡成熟培养液(α?MEM，5%FCS，0.1 IU/mL FSH，0.01 IU/mL LH，1% ITS，1.5 IU/mL hCG);第13天，在加入卵泡成熟培养液后26 h收集排出的卵丘复合体(OGCs)。
1.7 体外受精 每组的OGCs分别行体外受精。卵母细胞受精培养4 h后从受精滴中洗出，转移至预先平衡过的KSOM+AA的小液滴中培养。观察卵母细胞的成熟率(以含有第一极体的卵母细胞百分率代表)、受精率(以双原核卵母细胞占有第一极体卵母细胞的百分率代表)。
1.8 统计学处理 采用SPSS 11.5软分析。4组的卵泡存活率、培养卵泡各阶段成熟率、排卵率运用单因素方差分析(one way ANOVA)，各组均数以最小显著差法(least significant difference, LSD)进行两两比较和显著性检验;卵母细胞成熟率和受精率采用χ2 检验。 2.1 分离卵泡回收量 经过分离操作后，显微镜下可见大量腔前卵泡，大部分卵泡呈圆或椭圆形，边界清楚，部分卵泡外周附有或多或少的卵巢间质组织，卵母细胞成圆形，位于卵泡中央，透明带清晰可见(图1A)。体视镜下回收卵泡边界清晰、光滑的卵泡，计数各组回收卵泡量(表1)。表1 各组卵泡回收量比较
2.2 双荧光染色结果 卵泡双荧光染色后，在蓝光的激发下，活细胞显示绿色荧光，死亡细胞则呈红色荧光。将卵母细胞呈绿色、卵泡细胞≥70%呈绿色者视为存活卵泡(图1B)。各组活卵泡的百分率见表2。表2 各组卵泡存活率比较
2.3 卵泡体外培养结果 每组卵泡在相同条件下培养12 d，计数5、12 d的卵泡残存率;在加入hCG 26 h后，计数排卵率。各组各项指标的结果见表3。表3 各组卵泡体外培养结果比较
2.4 体外受精结果 各组收获OGCs分别受精，获能精子密度控制在5×105 mL?1。早期胚置于KSOM+AA中培养，卵的密度为每20 μL含 15个。成熟率及受精率的计数结果见表4。D组成熟率高于其他3组，余3组之间差别无统计学意义;受精率4个组之间无差别。表4 各组体外成熟与受精结果比较 近年来，多种哺乳动物，如小鼠、兔、猪及人的卵泡诱导发育技术体系都获得了很大进展[4?7]。在这些体系中，大多倾向于将卵巢中的卵泡单独分离出来后再进行培养。有报道表明，分离卵泡只有其基底膜未受损伤并带有少量间质细胞、未成熟圆形卵母细胞位于其中央时，体外培养才能成功[8]。迄今常用的卵泡分离方法有两种，包括利用水解酶(如链霉蛋白酶、胶原蛋白酶和脱氧核糖核酸酶)消化卵巢的结缔组织而获得游离卵泡的酶解法和用锐利器械剥离出卵泡的机械法[6,9?10]。就目前的资料来看，两种方法各有优缺点。酶解法是细胞生物学研究中分离各种组织、器官中细胞的常用方法，因其操作简便有效而受到普遍应用。酶解法分离卵泡时，普遍采用胶原蛋白酶和脱氧核糖核酸酶组合配制成分离液。这种分离液利用酶消化卵巢间质组织中的胶原蛋白，使卵泡从卵巢组织释放出来，故在限定时间里可望收获较多的游离卵泡。有报道表明，用酶解法分离卵泡培养的卵母细胞可有更高成熟率和卵裂率的趋势[11]。但是，分离液长时间浸泡卵巢组织时，显然可能导致卵泡基底膜受到损伤，从而使卵泡在后续培养中更易于退化，降低了卵泡培养的残存率，因此酶的作用浓度和时间是个关键的问题。
用机械法分离卵泡，如果操作手法得当，可能保持卵泡基底膜的完整，从而在体外培养过程中更容易维持卵泡的立体结构，保障更高的培养残存率。Carrell等和Park等的结果显示，用机械法分离的卵泡，其残存率存活率显著高于用酶解法分离者[12?13];Shen等还进一步利用机械法来源的小鼠卵泡培育成熟卵母细胞并成功制备了IVF?ET小鼠[4]。但是，也有报道表明，移植后卵巢切片显示有些腔前卵泡的卵母细胞与其周围颗粒细胞的联系很薄弱[14]。用机械法从致密的卵巢间质组织中分离卵泡时，往往难于避免牵拉卵泡的力量过大，很容易破坏卵母细胞与颗粒细胞的连接，而卵母细胞和颗粒细胞的缝隙连接异常，会影响卵母细胞的发育并导致减数分裂阻断[15?16]。故机械法能否保障卵泡存活率在很大程度上依赖于操作技巧，同时在有限的分离操作时间里很难提高卵泡的回收量。从目前的报道来看，单用机械法从每枚卵巢中得到的卵泡数量非常有限，平均每个卵巢只有12.51和11.27个[4,14]。
本研究结果表明，酶解法的卵泡回收量、分离后卵泡培养的残存率、排卵率均低于机械法(表1，3)，但分离刚结束时的卵泡活率却高于机械法(表2)。此结果与Demeestere等的报道不符，却与Carrell等和Park等的报道相似[11?13]。说明酶解法在分离卵泡时对卵泡造成的直接损伤较少，但对卵泡的远期存活不利。值得注意的是，本研究采用酶解法分离卵泡时，设置了C组即短时酶解法，采用酶解过程中每隔5 min收获1次卵泡的改变法，而该组的排卵率显著高于常规的20 min酶解处理组，证明减少酶的作用时间是有价值的。
为了提高分离卵泡的回收量，同时又保障较高的培养残存率、排卵率和卵泡的生殖潜能，本研究建立了将酶解法和机械法相结合来分离新生小鼠卵巢移植物中腔前卵泡的技术方案。在结合法(D组)中，将卵巢组织块先在含有胶原蛋白酶和脱氧核糖核酸酶的分离液中37 ℃消化5 min，随即采用与单纯机械法相同的操作手法进行剥离，同时将剥离出的卵泡立即转移至不含酶的培养液中。此做法利用酶的消化作用使卵泡周围的结缔组织得到一定消化，卵巢组织变得比较松散，从而减少机械剥离时对卵泡的牵拉损伤，同时又使游离出的卵泡及时离开分离液，减少了水解酶对卵泡的作用时间，比单纯酶解法或单纯机械法更有利于保持卵泡的三维结构。实验结果表明，D组中分离后卵泡的存活率与单纯酶解法(B、C组)无差别，但高于单纯机械法(A组)，而每块卵巢的卵泡回收量、平均排卵数、卵母细胞成熟率多项指标均高于其他各组，说明结合法具有绝对优于两法单用的趋势。同时，采用结合法从每个卵巢移植块获得97.13个卵泡(相当于194卵泡/卵巢)其中40.66%达到排卵，显著高于国内外文献所报道的相应数据。值得注意的是，本研究用来源于4种分离方法所培育的卵母细胞进行体外受精，其受精率在各组间并无显著差异，说明分离技术只对卵泡在后续培养中的发育与成熟有影响，而对那些发育至成熟的卵母细胞的生殖潜能并无显著影响。
实验结果提示，本研究建立的酶解?机械结合法是一个良好的卵泡分离技术，对卵巢组织工程的技术进步具有实际应用价值。
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Ⅳ 苏芙蛋白酶颗粒的成分
链霉蛋白酶颗粒为蛋白分解酶,白色至淡褐色颗粒,微有特异的气味,是从链球菌中分离到的一种丝氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物.通过切断胃粘液的主要成分粘蛋白的...
Ⅳ 胶囊内镜检查前需要做哪些准备
一、检查前
1、前一天进流食，禁食蔬菜水果。
2、前一天晚及检查当前早晨在医生指导下口服泻剂，清洁肠道。
3、检查当天穿宽松两件套的衣服。
4、胃肠道梗阻、狭窄或瘘管、体内有心脏起搏器或植入有其他电子医学仪器、孕产妇、吞咽困难、拒绝手术者不宜做胶囊内镜检查。
二、检查中
1、将患者信息录入工作站电脑软件。
2、安装Given数据记录仪及其附属装置，将阵列传感器粘贴在患者胸腹部的正确位置上、佩带记录仪腰带等。
3、吞服胶囊前3-5分钟口服祛泡剂。
4、吞服胶囊内镜后，并用笔记本电脑实时监测半小时，确保胶囊正常工作后，患者可离开诊室。
5、嘱患者使用专用表格记录检查过程中的事件和胶囊排出时间。
6、特别注意叮嘱患者在胶囊排出体外前排便一定要排在便盆内，确定胶囊排出体外、并无任何损坏。
三、检查后
1、在吞服胶囊内镜之后至少2小时内禁饮食，2小时后患者可饮水，4小时后可进流质、半流质饮食，检查结束后可恢复正常饮食。
2、患者吞服胶囊内镜后可自由走动，但不要远离检查场所，保证患者在吞服胶囊后8小时内处于医学监护之下。
3、避免接近任何强力电磁源区域，如核磁共振（MRI）、无线电台，以免影响胶囊内镜的正常工作。
4、患者如出现上腹痛、恶心、呕吐等不适症状应及时告知术者，并定时检测数据记录仪指示灯情况，明确其工作是否正常。
5、检查结束后，将数据记录仪中及时返还。由医师将记录仪中的图像下载到工作站中，供内镜医师观察和诊断。
6、检查后第三日患者可取胶囊内镜报告单，或根据内镜中心通知领取报告单。
Ⅵ 关于海带褐藻多糖硫酸酯的水提取的资料（中文和英文的）期刊什么的都行， 链接也可以
褐藻多糖硫酸酯是一类独特的水溶性硫酸杂多糖,具有多种生物活性。研究用复合酶法提取分离羊栖菜褐藻多糖硫酸酯,利用动物试验,分析羊栖菜褐藻多糖硫酸酯和日本厚叶海带、真海带、大连厚叶海带、裙带菜的褐藻多糖硫酸酯对小鼠的降血脂作用。动物实验结果表明,日本厚叶海带、真海带和羊栖菜高剂量组、裙带菜低剂量组的褐藻多糖硫酸酯显著降低了TC、TG水平;大连厚叶海带和羊栖菜低剂量组、裙带菜高剂量组的褐藻多糖硫酸酯显著降低了TG水平;各褐藻多糖硫酸酯组均显著降低了LDL-C水平。比较5种褐藻多糖硫酸酯对小鼠体内抗氧化酶的影响,表明日本厚叶海带和羊栖菜的褐藻多糖硫酸酯各剂量组均显著降低了MDA水平;日本厚叶海带、真海带和大连厚叶海带的高剂量组均显著升高了SOD水平,而羊栖菜和裙带菜褐藻多糖硫酸酯的低剂量组具有同样作用;除羊栖菜低剂量组,其余各组均显著升高了GSH-Px水平;同样,除日本厚叶海带和羊栖菜高剂量组,其余各组均显著升高了NO值。研究结果显示这5种褐藻多糖硫酸酯具有较好的降血脂、抗氧化作用。
制作单位是大连海洋大学食品科学与工程学院 国家海藻加工技术研发分中心 辽宁省水产品加工及综合利用重点实验室;
获得海洋公益性行业科研专项项目
Ⅶ 作胃镜服二甲硅油还是链霉蛋白酶颗粒怎样安装萌萌报时软件
做胃镜前喝的是药物应该是利多卡因胶浆，这个药物起到局部麻醉的作用。主要是减轻进行胃镜检查时的咽喉刺激症状，麻药的作用一般是6个小时后才能完全吸收，刚做完胃镜会感觉咽喉部麻木粗厚。6个小时以后吃点稀饭，不吃辛辣食物，避免食物进入气管。